一文读懂酶联免疫吸附实验（ELISA）原理及步骤

  酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种广泛应用于生命科学研究和临床诊断的免疫分析技术。该技术利用抗原抗体特异性结合的原理，通过酶促反应将待测物质的存在与可检测的信号（例如颜色变化）联系起来，从而实现对目标分子的定性和定量分析。ELISA具有高灵敏度、高特异性、操作简便、成本效益高等优点，使其成为研究人员和临床医生常用的工具。

ELISA试剂盒

  ELISA可以用于检测多种类型的生物分子，包括蛋白质、肽、激素、抗体、细胞因子等。其应用范围涵盖免疫学、细胞生物学、分子生物学、生物化学、临床医学、食品安全、环境监测等多个领域。例如，ELISA可以用于：

•   检测疾病标志物：辅助疾病的诊断、预后评估和治疗监测

•   研究蛋白质表达和功能：分析细胞信号通路和蛋白质相互作用

•   药物开发和筛选：评估药物的疗效和安全性

•   食品安全检测：检测食品中的污染物和毒素

•   环境监测：检测环境样品中的污染物

  本文将详细介绍ELISA技术的原理、类型步骤、应用和注意事项，帮助读者全面了解和掌握这项重要的实验技术。

  ELISA技术原理

  酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种基于抗原抗体特异性结合的检测技术，将已知抗原和抗体结合在固相载体（酶标板）表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本加入固相载体，使其与表面吸附的抗体或抗原发生反应。随后，加入酶标记的抗原或抗体，进一步形成复合物。 通过洗涤去除未结合的物质后，加入酶底物进行显色反应。 根据显色结果，可以定性或定量分析目标分子的存在和含量。

图1  ELISA原理

  ELISA实验中常见的试剂

•   固相抗原和抗体。固相抗原和抗体是ELISA实验关键试剂，抗原和抗体在酶标板特异性结合反应解决生物学科研难题。

•   酶标记抗体。酶标记抗体是链接特异性抗原识别和信号放大桥梁。它能够识别并结合样品中目标抗原上的特定抗原表位，并偶联一种酶（例如辣根过氧化物酶 HRP 或碱性磷酸酶 AP），加入底物，酶会催化底物发生反应，产生可检测的信号。

•   底物。底物是实验最后阶段，它和没标记抗体反应时，实验的结果将在酶标板上显出色彩和荧光剂。

  ELISA常见的类型及步骤

  直接法ELISA

  将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。

图2 直接ELISA法

  直接ELISA法步骤：

•   将已知的抗原按一定比例稀释后，包被到酶标板或其他固相载体表面，形成一层抗原涂层。

•   加入针对该抗原的特异性酶标抗体，使其与固相载体上的抗原结合。在适宜的温度和时间下孵育，使抗原抗体充分结合。去除未结合的酶标抗体。

•   加入酶的底物，底物被酶催化后发生显色反应，产生可检测的颜色变化。 根据显色结果，可以定性或定量分析样品中目标抗原的存在和含量。

  直接法ELISA的优点是：

•   操作步骤简单，耗时短。

•   不需要使用二抗，避免了二抗可能带来的交叉反应。

  直接法ELISA的缺点是：

•   灵敏度较低，不适用于检测低丰度抗原。

•   每种靶抗原都需要制备相应的酶标抗体，成本较高。

  间接法ELISA

  将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原一待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。

图3 间接法ELISA

间接法ELISA步骤：

  

• 将已知抗原固定在固相载体上：类似于直接法ELISA，首先将已知的抗原包被到酶标板或其他固相载体表面。

•   加入待测抗体：加入待测样本（例如血清），如果样品中含有针对该抗原的特异性抗体，则会与固相载体上的抗原结合。

•   加入酶标二抗：加入带有酶标记的二抗，二抗可以识别并结合待测抗体的Fc段。

•   孵育、洗涤、显色、判读结果：与直接法ELISA类似，经过孵育、洗涤、显色等步骤后，根据显色结果可以判断样品中是否存在针对该抗原的特异性抗体，并进行定量分析。

  间接法ELISA的优点是：

•   灵活性高，可以使用一种酶标二抗检测多种不同的抗体，只需更换固相抗原即可。

•   灵敏度较高，因为二抗可以放大信号。

  间接法ELISA的缺点是：

•   操作步骤比直接法ELISA复杂，耗时较长。

•   可能会发生非特异性结合和交叉反应，影响检测结果的准确性。

  夹心法ELISA

  夹心法ELISA分为直接夹心法和间接夹心法，检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。

图4 夹心法ELISA

  夹心法 ELISA 步骤：

•   包被捕获抗体：将捕获抗体固定在ELISA板上。

•   加入待测样品：加入待测样品，如果样品中含有目标抗原，则会被捕获抗体捕获。

•   加入检测抗体：加入检测抗体，检测抗体可以识别并结合目标抗原上的另一个表位。

•   后续步骤：根据检测抗体是否带有酶标记，进行直接或间接ELISA的后续步骤(孵育、洗涤、显色、判读结果)。

  夹心法ELISA优点：

•   高灵敏度：由于使用了两种抗体来识别抗原，夹心法ELISA具有很高的灵敏度，可以检测到低丰度的抗原。

•   高特异性：两种抗体识别抗原上不同的表位，大大降低了非特异性结合和交叉反应的可能性，提高了检测的特异性。

•   适用范围广：可以用于检测多种类型的抗原，包括蛋白质、多肽、激素等。

•   操作相对简单：与竞争法ELISA相比，夹心法ELISA的操作步骤相对简单。

  夹心法ELISA缺点：

•   需要配对抗体：进行夹心法ELISA需要两种针对不同表位的抗体，配对抗体的选择和验证比较关键，也增加了实验成本。

•   不适用于小分子抗原：夹心法ELISA需要抗原具有至少两个抗体结合位点，因此不适用于检测小分子抗原。

•   可能存在钩状效应：当抗原浓度过高时，可能会出现钩状效应，导致检测信号降低，影响结果的准确性。

  竞争法ELISA

  首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。

•   包被捕获抗体：将特异性抗体（捕获抗体）固定在固相载体表面。

•   分组：将酶标板分成两组，一组加入待测样品和酶标抗原的混合物，另一组只加入酶标抗原。

•   竞争结合：待测样品中的抗原和酶标抗原会竞争结合固相载体上的捕获抗体。

•   孵育、洗涤、显色：经过孵育、洗涤、显色等步骤后，两组都会产生颜色反应。

•   结果分析：待测样品中抗原浓度越高，与酶标抗原竞争结合捕获抗体的能力越强，导致结合到固相载体上的酶标抗原越少，最终显色信号越弱。通过比较两组的显色信号差异，可以间接反映待测样品中抗原的浓度。

  竞争法ELISA的优点是：

•   可以检测小分子抗原：适用于检测只有一个表位的抗原，例如激素、药物等。

•   对样品纯度要求低：样品中的杂质对检测结果的影响较小。

  竞争法ELISA的缺点是：

•   灵敏度较低：与夹心法ELISA相比，竞争法ELISA的灵敏度较低。

•   操作步骤相对复杂：需要设置对照组，并进行信号差异的比较。

  ELISA样本及应用

  ELISA可检测和计数体液样本中的某些抗体、抗原、蛋白质和激素。这包括血液、血浆、尿液、唾液（唾液）和脑脊液（CSF）。

  ELISA是免疫测定的黄金标准。使用ELISA的测试可以帮助诊断多种疾病，从细菌和病毒感染（如莱姆病和HIV）到内分泌疾病（如甲状腺疾病）。

  家庭妊娠测试甚至基于ELISA技术。他们检测到一种叫做人绒毛膜促性腺激素（HCG）的激素——“怀孕激素”。

  ELISA广泛用于食品行业，用于检测法律要求的成分标签中是否存在过敏原。该应用极大地受益于ELISA的灵敏度，并且可以检测浓度低至百万分之几(ppm)的潜在食品过敏原污染物的水平。它还具有能够检测油和其他物质（如蛋清或牛奶）的优点，而PCR等无法检测到这些物质。

  使用ELISA试剂盒时的注意事项

  该试剂盒仅适用于研究目的，不适用于诊断或治疗用途。

  ELISA试剂盒过期后必须停止使用。

  尽量不要将不同批次的试剂混入试剂盒中。

  该试剂盒的制作和测试用于检测特定样品以及手册中存在的目标。最终用户必须非常小心地将其进一步用于任何其他目的。

  ELISA试剂盒的安全说明

  ELISA试剂盒提供的终止液通常是酸性溶液。确保正确安全地使用试剂，以避免任何风险。

  您必须处理并丢弃所有生物材料，因为它们是潜在有害的材料。因此，请务必遵守当地的规则和法规。

  手套、实验服、护目镜和外科口罩等个人安全设备是这些实验的必需品。吸入任何这些物质都会产生副作用。

  使任何ELISA检测成功的技巧

  任何ELISA检测都不可能在一夜之间取得成功。最终的努力可以实现这一目标。下面给出了一些成功ELISA检测的有用技巧。

  一致性是关键

  虽然一致性似乎是一个显而易见的目标，但有一些假设可能会影响其在板之间的存在。应该避免混合ELISA试剂盒中的不同成分，因为它们可能会导致潜在的损害。

  确保测定的准确性

  您可以通过确保检测中的每个点都有重复项来努力提高其准确性。这可能包括从背景到样品孔的任何内容。最重要的是，它可以让您立即识别任何异常值。

  防止污染

  ELISA测定成功的关键是样品的变异系数较低。确保它们都没有超过理想的百分比，因为它可能导致进一步的污染。

  好了，上述为大家介绍了酶联免疫吸附实验（ELISA）原理和步骤。在ELISA实验中大家严格按照说明书进行实验，上文为大家介绍基本原理和步骤，也希望大家在实验过程善于总结。也祝大家实验顺利。